Einde inhoudsopgave
Verordening (EG) Nr. 152/2009 tot vaststelling van de bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders
Bijlage VI Analysemethoden voor de bepaling van bestanddelen van dierlijke oorsprong in het kader van de officiële controle op diervoeders
Geldend
Geldend vanaf 28-06-2022
- Bronpublicatie:
07-06-2022, PbEU 2022, L 155 (uitgifte: 08-06-2022, regelingnummer: 2022/893)
- Inwerkingtreding
28-06-2022
- Bronpublicatie inwerkingtreding:
07-06-2022, PbEU 2022, L 155 (uitgifte: 08-06-2022, regelingnummer: 2022/893)
- Vakgebied(en)
Agrarisch recht (V)
Gezondheidsrecht / Voedsel- en warenkwaliteit
1. Doel en toepassingsgebied
De bepaling van bestanddelen van dierlijke oorsprong in diervoeders wordt uitgevoerd met behulp van lichtmicroscopie of de polymerasekettingreactie (PCR) overeenkomstig de bepalingen van deze bijlage.
Met deze twee methoden kunnen bestanddelen van dierlijke oorsprong in voormengsels, voedermiddelen en mengvoeders worden aangetoond. Het gehalte aan die bestanddelen in voormengsels, voedermiddelen en mengvoeders kan met deze methoden echter niet worden berekend. Beide methoden hebben een aantoonbaarheidsgrens van minder dan 0,1 % (m/m).
Met de PCR-methode kan worden bepaald tot welke taxonomische groep de bestanddelen van dierlijke oorsprong in voormengsels, voedermiddelen en mengvoeders behoren.
Deze methoden gelden voor de controle op de toepassing van de verbodsbepalingen van artikel 7, lid 1, van Verordening (EG) nr. 999/2001 van het Europees Parlement en de Raad (1), van bijlage IV bij die verordening en van artikel 11, lid 1, van Verordening (EG) nr. 1069/2009 van het Europees Parlement en de Raad (2).
Afhankelijk van het soort diervoeder dat wordt onderzocht kunnen deze methoden afzonderlijk of in combinatie in één protocol worden gebruikt overeenkomstig de standaardwerkvoorschriften die door het EU-referentielaboratorium voor dierlijke eiwitten in diervoeders (EURL-AP) zijn vastgesteld en te vinden zijn op de website van dat laboratorium (3).
2. Methoden
2.1. Lichtmicroscopie
2.1.1. Beginsel
De bestanddelen van dierlijke oorsprong die kunnen worden aangetroffen in voormengsels, voedermiddelen en mengvoeders die ter analyse worden aangeboden, worden geïdentificeerd op basis van typische microscopisch identificeerbare kenmerken zoals spierweefsel en andere vleesdeeltjes, kraakbeen, bot, hoorn, haar, cuticulaire fragmenten van ongewervelde dieren, tracheale structuren van insecten, bloedproducten, melkdeeltjes, lactosekristallen, veren, eierschalen, visgraten en schubben.
Microscopisch onderzoek wordt uitgevoerd na voorbereiding van de monsters door sedimentatie.
Op de monsters wordt als volgt een sedimentatiestap uitgevoerd:
- a)
voor het aantonen van andere bestanddelen van dierlijke oorsprong dan van ongewervelde landdieren, een enkelvoudige sedimentatiestap met tetrachlooretheen zoals beschreven in punt 2.1.3.4.3;
- b)
voor het aantonen van bestanddelen van ongewervelde landdieren, een tweevoudige sedimentatiestap met petroleumether/tetrachlooretheen, zoals beschreven in punt 2.1.3.4.4.
2.1.2. Reagentia en uitrusting
- 2.1.2.1.Reagentia
- 2.1.2.1.1.Sedimentatievloeistof
- —
Tetrachlooretheen (dichtheid 1,62).
- —
Petroleumether (PE), kookpunt 40–60 °C (dichtheid 0,65).
- 2.1.2.1.2.Kleurstof
- —
Alizarineroodoplossing (verdun 2,5 ml zoutzuur 1 M in 100 ml water en voeg hieraan 200 mg alizarinerood toe).
- 2.1.2.1.3.Insluitmiddelen
- —
Loog (NaOH 2,5 % m/V of KOH 2,5 % m/V).
- —
Glycerol (onverdund, viscositeit 1 490 cP) of een insluitmiddel met gelijkwaardige eigenschappen voor het maken van niet-permanente preparaten.
- —
Norland Optical Adhesive 65® (viscositeit 1 200 cP) of een hars met gelijkwaardige eigenschappen voor het maken van permanente preparaten.
- 2.1.2.1.4.Als insluitmiddel te gebruiken kleurstoffen
- —
Lugoloplossing (los 2 g kaliumjodide op in 100 ml water en voeg onder geregeld schudden 1 g jood toe).
- —
Cystinereagens (2 g loodacetaat, 10 g NaOH/100 ml water).
- —
Fehlingsreagens (vóór gebruik bereid uit gelijke delen (1:1) van twee voorraadoplossingen A en B: oplossing A (los 6,9 g koper(II)sulfaat-pentahydraat op in 100 ml water); oplossing B (los 34,6 g kaliumnatriumtartraat-tetrahydraat en 12 g NaOH op in 100 ml water).
- —
Tetramethylbenzidine/waterstofperoxide (los 1 g 3,3″,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) op in 100 ml ijsazijn en 150 ml water. Meng voor gebruik vier delen van deze TMB-oplossing met één deel 3 %-ige waterstofperoxide).
- 2.1.2.1.5.Wasvloeistoffen
- —
Ethanol ≥ 96 % (technisch zuiver).
- —
Aceton (technisch zuiver).
- 2.1.2.1.6.Bleekmiddel
- —
Natriumhypochlorietoplossing, in handelskwaliteit (9–14 % actief chloor).
- 2.1.2.2.Uitrusting
- —
Analytische balans, nauwkeurigheid 0,001 g.
- —
Verkleiningsapparatuur: mes of rotormolen. Bij gebruik van een rotormolen zijn mazen van ≤ 0,5 mm verboden.
- —
Zeven met vierkante mazen van 0,25 mm en 1 mm maaswijdte. Behalve bij het voorzeven van het monster mag de diameter van de zeven niet groter zijn dan 10 cm om verlies van materialen te voorkomen. IJking van de zeven is niet vereist.
- —
Conische glazen scheitrechter, inhoud 250 ml, van onderen voorzien van een kraan van teflon of geslepen glas, uitloopdiameter ≥ 4 mm. Uitsluitend voor enkelvoudige sedimentatie met tetrachlooretheen mag in plaats hiervan een imhoffglas worden gebruikt, mits het laboratorium heeft aangetoond dat hiermee gelijkwaardige detectieniveaus kunnen worden behaald als met de scheitrechter.
Scheitrechter
- —
Stereomicroscoop, eindvergroting minimaal 6,5×–40×.
- —
Samengestelde microscoop, eindvergroting minimaal 100×–400×, doorvallend licht, helderveld. Daarnaast mag van gepolariseerd licht en differentieel interferentiecontrast gebruik worden gemaakt.
- —
Gebruikelijk laboratoriumglaswerk.
- —
Uitrusting voor het maken van preparaten: standaard-objectglaasjes, holle objectglaasjes, dekglaasjes (20 × 20 mm), pincet, smalle spatel.
- —
Laboratoriumoven.
- —
Centrifuge.
- —
Filterpapier: kwalitatieve cellulosefilter (poriëngrootte 4–11 μm).
2.1.3. Bemonstering en monstervoorbereiding
- 2.1.3.1.Bemonstering
Er wordt uitgegaan van een representatief monster dat is genomen overeenkomstig bijlage I.
- 2.1.3.1.1.Drogen
Monsters met een hoger vochtgehalte dan 14 % worden vóór behandeling overeenkomstig bijlage III gedroogd.
- 2.1.3.1.2.Voorzeven
Om informatie te verzamelen over mogelijke milieuverontreiniging van het diervoeder, wordt aanbevolen om diervoeder in pellets en pitten voor te zeven met 1 mm maaswijdte en beide fracties als afzonderlijke monsters voor te bereiden, te analyseren en er verslag van uit te brengen.
- 2.1.3.2.Voorzorgsmaatregelen
Om kruisverontreiniging in het laboratorium te vermijden, moet alle herbruikbare uitrusting vóór gebruik zorgvuldig gereinigd worden. De scheitrechter moet voor het reinigen uit elkaar worden genomen. De onderdelen van de scheitrechter en het glaswerk worden eerst met de hand en vervolgens machinaal gewassen. De zeven moeten worden gereinigd met een borstel met harde, synthetische haren. Na het zeven van vettig materiaal zoals vismeel wordt aangeraden de zeven tot slot nog met aceton en perslucht te reinigen.
- 2.1.3.3.Voorbereiding van monsters van oliën of vetten
Het volgende protocol moet worden gevolgd voor de voorbereiding van monsters van vetten:
- —
verwarm vast vet in een oven tot het gesmolten is;
- —
pipetteer 40 ml vet of olie van het onderste gedeelte van het monster in een centrifugebuis;
- —
centrifugeer het monster gedurende 10 min bij 4 000 omwentelingen per minuut.
- —
als het vet na centrifugeren vast is, verwarm het dan in een oven tot het gesmolten is;
- —
centrifugeer nogmaals gedurende 5 min bij 4 000 omwentelingen per minuut;
- —
breng de helft van de gedecanteerde onzuiverheden met een lepel of spatel over op een objectglaasje voor microscopisch onderzoek. Als insluitmiddel wordt glycerol aanbevolen;
- —
de resterende onzuiverheden worden gebruikt voor sedimentatie zoals beschreven in punt 2.1.3.4.3, eerste streepje.
Hetzelfde protocol, met uitzondering van het eerste en het vierde streepje, wordt toegepast voor de bereiding van monsters bestaande uit oliën.
- 2.1.3.4.Voorbereiding van monsters, met uitzondering van monsters van oliën of vetten
- 2.1.3.4.1.
Nemen van deelmonsters en malen: van het monster wordt een deelmonster voor analyse genomen van ten minste 50 g, dat wordt gemalen.
- 2.1.3.4.2.
Bereiding van het ruwe materiaal: er wordt ten minste 5 g van het gemalen deelmonster bereid. Het materiaal wordt met een maaswijdte van 0,25 mm gezeefd en de twee resulterende fracties worden onderzocht.
- 2.1.3.4.3.
Enkelvoudige sedimentatie met tetrachlooretheen voor het aantonen van andere bestanddelen van dierlijke oorsprong dan van ongewervelde landdieren.
- —
Afscheiding en bereiding van het sediment:
breng 10 g van het gemalen deelmonster (tot op 0,01 g nauwkeurig afgewogen) in de scheitrechter of het imhoffglas en voeg 50 ml tetrachlooretheen toe. In het geval van vismeel of andere puur dierlijke producten, minerale ingrediënten of voormengsels die meer dan 10 % sediment opleveren, wordt maximaal 3 g in de scheitrechter gebracht. Schud het mengsel gedurende minimaal 30 s krachtig, en voeg daarna voorzichtig 50 ml tetrachlooretheen toe langs de binnenwand van de trechter om de aangehechte deeltjes weg te spoelen. Laat het resulterende mengsel ten minste 5 min staan en scheid vervolgens het sediment af door de kraan te openen.
Bij gebruik van een imhoffglas wordt het mengsel gedurende ten minste 15 s krachtig geroerd waarna eventuele deeltjes aan de binnenwand van het glas zorgvuldig worden weggespoeld met ten minste 10 ml zuiver tetrachlooretheen. Laat het mengsel vervolgens 3 min staan en roer daarna opnieuw gedurende 15 s, waarna eventuele deeltjes tegen de binnenwand van het glas zorgvuldig worden weggespoeld met ten minste 10 ml zuiver tetrachlooretheen. Laat het resulterende mengsel ten minste 5 min staan en schenk de vloeibare fractie daarna voorzichtig af zonder dat het sediment meekomt.
Het sediment wordt verzameld op een filtreerpapier dat in een trechter wordt geplaatst om het resterende tetrachlooretheen te scheiden terwijl vetafzetting in het sediment wordt vermeden. Het sediment wordt gedroogd. Vervolgens wordt aanbevolen het sediment (tot op 0,001 g nauwkeurig) te wegen om de sedimentatiestap te controleren. Ten slotte wordt het sediment met een maaswijdte van 0,25 mm gezeefd en worden de twee resulterende fracties onderzocht, tenzij zeven niet nodig wordt geacht.
- —
Afscheiding en bereiding van het flotaat:
na afscheiding van het sediment zoals hierboven beschreven moeten in de scheitrechter twee fasen achtergebleven zijn: een vloeibare fase bestaande uit tetrachlooretheen en een vaste fase van drijvend materiaal. Deze vaste fase is het flotaat en wordt verkregen door de kraan van de scheitrechter te openen en het tetrachlooretheen volledig te laten uitlopen. Vervolgens wordt de scheitrechter omgekeerd, waarna het flotaat in een grote petrischaal wordt gebracht en in een zuurkast wordt gedroogd. Het materiaal wordt met een maaswijdte van 0,25 mm gezeefd en de twee resulterende fracties worden onderzocht.
- —
Gebruik van kleurstoffen:
om de bestanddelen van dierlijke oorsprong gemakkelijker correct te kunnen identificeren kan de analist bij de voorbereiding van de monsters kleurstoffen gebruiken volgens de richtsnoeren van het EURL-AP, die op de website van dat laboratorium te vinden zijn.
Bij gebruik van alizarineroodoplossing voor kleuring van het sediment geldt het volgende protocol:
- —
breng het gedroogde sediment over in een glazen reageerbuis en spoel tweemaal met ongeveer 5 ml ethanol (beide keren 30 s vortexen, ongeveer 1 min 30 s laten bezinken en de vloeistof afschenken);
- —
bleek het sediment door toevoeging van ten minste 1 ml natriumhypochlorietoplossing. Laat gedurende 10 min reageren. Vul de reageerbuis met water, laat het sediment 2–3 min bezinken en schenk het water en de gesuspendeerde deeltjes voorzichtig af;
- —
spoel het sediment vervolgens tweemaal met ongeveer 10 ml water (beide keren 30 s vortexen, laten bezinken en het water afschenken);
- —
voeg 2–10 druppels alizarineroodoplossing toe en vortex het mengsel. Laat 30 s reageren en spoel het gekleurde sediment tweemaal met ongeveer 5 ml ethanol en vervolgens eenmaal met aceton (beide keren 30 s vortexen, ongeveer 1 min laten bezinken en de vloeistof afschenken);
- —
droog het gekleurde sediment.
- 2.1.3.4.4.
Tweevoudige sedimentatie met petroleumether/tetrachlooretheen voor het aantonen van bestanddelen van ongewervelde landdieren.
Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een conische glazen scheitrechter van 250 ml, zoals beschreven in punt 2.1.2.2, vierde streepje.
- —
breng 10 g van het gemalen deelmonster (tot op 0,01 g nauwkeurig afgewogen) in de scheitrechter en onderwerp dit eerst aan een enkelvoudige sedimentatie met tetrachlooretheen zoals beschreven in punt 2.1.3.4.3, met inbegrip van het afscheiden van het sediment op een filtreerpapier dat in een trechter wordt geplaatst. Dit sediment kan worden gebruikt als het volgens punt 2.1.3.4.3 verkregen sediment.
- —
Breng de kleine hoeveelheid tetrachlooretheen die samen met het sediment wordt afgescheiden, in een maatcilinder over. Vul, door de afsluitkraan van de scheitrechter te openen, de maatcilinder verder, totdat 30 ml tetrachlooretheen is verkregen. Sluit de afsluitkraan zodra deze hoeveelheid is bereikt.
- —
Deze opgevangen hoeveelheid tetrachlooretheen wordt vervangen door een volume van 30 ml petroleumether, kookpunt 40–60 °C, aan de scheidingstrechter toe te voegen. Meng de inhoud van de scheitrechter grondig om een mengsel van 30 % petroleumether/70 % tetrachlooretheen (met een dichtheid van ongeveer 1,26 g/cm3) te verkrijgen. Laat het materiaal gedurende 10 min rusten. Er worden twee nieuwe fracties gevormd: een tweede sediment en een uiteindelijk flotaat (< 1,26 g/cm3). Het tweede sediment wordt in een petrischaal (of een filtreerpapier dat in een trechter wordt geplaatst) opgevangen door de afsluitkraan te openen totdat slechts een kleine hoeveelheid van het mengsel van oplosmiddelen en het uiteindelijke flotaat in de scheitrechter zijn achtergebleven. De resterende vloeistof en het uiteindelijke flotaat worden afzonderlijk opgevangen op een filtreerpapier dat in een trechter wordt geplaatst. Spoel de binnenwand van de scheitrechter af met petroleumether om al het materiaal van het uiteindelijke flotaat op te vangen. Laat het uiteindelijke flotaat drogen. Het uiteindelijke flotaat wordt met een maaswijdte van 0,25 mm gezeefd en de twee resulterende fracties worden onderzocht met het oog op het aantonen van bestanddelen van ongewervelde landdieren, tenzij zeven niet nodig wordt geacht.
2.1.4. Microscopisch onderzoek
- 2.1.4.1.Bereiding van de preparaten
Er worden microscopische preparaten vervaardigd van het sediment en, naar keuze van de analist, van het flotaat of het ruwe materiaal. In voorkomend geval worden, uitsluitend voor het aantonen van bestanddelen van ongewervelde landdieren, ook preparaten vervaardigd van het overeenkomstig punt 2.1.3.4.4 verkregen uiteindelijke flotaat. De twee resulterende fracties (de fijne en de grove) worden bereid. De op de objectglaasjes aangebrachte analysemonsters moeten representatief zijn voor de hele fractie.
Het aantal vervaardigde preparaten moet voldoende zijn om het volledige onderzoekprotocol van punt 2.1.4.2 uit te voeren.
De preparaten worden ingesloten met geschikt insluitmiddel overeenkomstig de standaardwerkvoorschriften van het EURL-AP, die te vinden zijn op de website van dat laboratorium. De preparaten worden met dekglaasjes afgedekt.
- 2.1.4.2.Stroomschema voor microscopische detectie van deeltjes van dierlijke oorsprong in mengvoeders, voedermiddelen en voormengsels
De microscopische preparaten worden bekeken volgens de stroomschema's in de diagrammen 1 en 2.
Het microscopisch onderzoek wordt uitgevoerd met de samengestelde microscoop op het sediment en, naar keuze van de analist, op hetzij het flotaat hetzij het ruwe materiaal. Daarnaast wordt, met het oog op het aantonen van bestanddelen van ongewervelde landdieren, ook het overeenkomstig punt 2.1.3.4.4 verkregen uiteindelijke flotaat bekeken volgens diagram 3. Voor de grove fracties kan behalve de samengestelde microscoop ook de stereomicroscoop worden gebruikt. Elk preparaat wordt in zijn geheel bij diverse vergrotingen onderzocht. Het gebruik van de stroomschema's wordt gedetailleerd beschreven in de standaardwerkvoorschriften van het EURL-AP, die te vinden zijn op de website van dat laboratorium.
Het minimumaantal preparaten dat in elke stap van het stroomschema moet worden onderzocht, moet strikt worden aangehouden, tenzij de fractie te klein is om het voorgeschreven aantal preparaten te maken, bijvoorbeeld wanneer geen sediment aanwezig is. Per bepaling worden maximaal zes preparaten gebruikt voor het bepalen van het aantal deeltjes.
Wanneer van het flotaat of het ruwe materiaal extra preparaten worden vervaardigd met specifiekere insluitmiddelen met kleurwerking, zoals beschreven in punt 2.1.2.1.4, voor de verdere karakterisering van structuren (bv. veren, haren, spieren of bloeddeeltjes) die zijn aangetroffen op met andere insluitmiddelen vervaardigde preparaten, zoals beschreven in punt 2.1.2.1.3, wordt het aantal deeltjes geteld op basis van niet meer dan zes preparaten per bepaling, met inbegrip van de extra preparaten met een specifieker insluitmiddel. Voor het aantonen van andere typen (gewervelde landdieren en vissen) worden de voor het aantonen van bestanddelen van ongewervelde landdieren vervaardigde extra preparaten van het overeenkomstig punt 2.1.3.4.4 verkregen uiteindelijke flotaat, niet in aanmerking genomen.
Om de aard en oorsprong van de deeltjes gemakkelijker te kunnen vaststellen mag de analist gebruikmaken van hulpmiddelen als beslissingsondersteunende systemen, beeldbanken en referentiemonsters.
Diagram 1
Stroomschema na enkelvoudige sedimentatie met tetrachlooretheen voor het opsporen van andere dan van ongewervelde landdieren afkomstige deeltjes van dierlijke oorsprong in mengvoeders, voedermiddelen en voormengsels, eerste bepaling
Diagram 2
Stroomschema na enkelvoudige sedimentatie met tetrachlooretheen voor het opsporen van andere dan van ongewervelde landdieren afkomstige deeltjes van dierlijke oorsprong in mengvoeders, voedermiddelen en voormengsels, tweede bepaling
Diagram 3
Stroomschema na tweevoudige sedimentatie met petroleumether/tetrachlooretheen voor het opsporen van bestanddelen van ongewervelde landdieren in mengvoeders, voedermiddelen en voormengsels
- 2.1.4.3.Aantal bepalingen
De bepalingen worden uitgevoerd op verschillende deelmonsters van elk 50 g.
Als in de eerste bepaling overeenkomstig het stroomschema van diagram 1, of in voorkomend geval van diagram 3, geen deeltjes van dierlijke oorsprong worden aangetoond, is geen verdere bepaling nodig en wordt het analyseresultaat uitgedrukt zoals aangegeven in punt 2.1.5.1.
Als in de eerste bepaling overeenkomstig het stroomschema van diagram 1 een of meer deeltjes van dierlijke oorsprong van een bepaald type (gewerveld landdieren of vissen) worden aangetoond, en het type van de aangetroffen deeltjes de aangegeven inhoud van het monster bevestigt, is een tweede bepaling niet nodig. Als het aantal deeltjes van dierlijke oorsprong van een bepaald type die in deze eerste bepalingen zijn aangetoond, groter is dan 5, wordt het analyseresultaat gerapporteerd per diercategorie en uitgedrukt zoals aangegeven in punt 2.1.5.3. Is dit niet het geval, dan wordt het analyseresultaat gerapporteerd per diercategorie en uitgedrukt zoals aangegeven in punt 2.1.5.2.
Als in de eerste bepaling overeenkomstig het stroomschema van diagram 3 meer dan 5 deeltjes van ongewervelde landdieren worden aangetoond, is geen tweede bepaling nodig en wordt het analyseresultaat uitgedrukt zoals aangegeven in punt 2.1.5.3 voor dit type.
In alle andere gevallen, ook wanneer geen inhoudverklaring aan het laboratorium is verstrekt, wordt een tweede bepaling uitgevoerd met een nieuw deelmonster. Als na de tweede bepaling overeenkomstig het stroomschema van diagram 2, of in voorkomend geval van diagram 3, het totale aantal deeltjes van dierlijke oorsprong van een bepaald type die in de drie bepalingen samen zijn aangetoond, groter is dan 10, wordt het analyseresultaat gerapporteerd per diercategorie en uitgedrukt zoals aangegeven in punt 2.1.5.3. Is dit niet het geval, dan wordt het analyseresultaat gerapporteerd per diercategorie en uitgedrukt zoals aangegeven in punt 2.1.5.2.
2.1.5. Weergave van de resultaten
Bij de rapportage van de resultaten geeft het laboratorium aan op welk materiaal de analyse is uitgevoerd (sediment, flotaat, uiteindelijk flotaat of ruw materiaal). Bij de rapportage moet duidelijk worden aangegeven hoeveel bepalingen zijn uitgevoerd en of het zeven van de fracties voorafgaand aan het voorbereiden van het preparaat, overeenkomstig punt 2.1.3.4.3, eerste streepje, derde alinea, of punt 2.1.3.4.4, derde streepje al dan niet is uitgevoerd.
Het laboratoriumverslag bevat ten minste informatie over de aanwezigheid van bestanddelen afkomstig van gewervelde landdieren en van vissen.
De verschillende situaties worden gerapporteerd zoals hieronder aangegeven.
- 2.1.5.1.
Er zijn geen deeltjes van dierlijke oorsprong van een bepaald type aangetoond:
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster geen deeltjes afkomstig van gewervelde landdieren aangetoond.’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster geen deeltjes afkomstig van vissen aangetoond.’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster geen deeltjes afkomstig van ongewervelde landdieren aangetoond.’.
- 2.1.5.2.
Er zijn minimaal 1 en maximaal 5 deeltjes van dierlijke oorsprong van een bepaald type aangetoond indien slechts één bepaling is uitgevoerd, of er zijn minimaal 1 en maximaal 10 deeltjes van dierlijke oorsprong van een bepaald type aangetoond in geval van twee bepalingen (het aantal aangetoonde deeltjes ligt onder de beslissingsgrens die is vastgesteld in de standaardwerkvoorschriften van het EURL-AP en te vinden is op de website van dat laboratorium):
indien slechts één bepaling is uitgevoerd:
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster niet meer dan 5 deeltjes afkomstig van gewervelde landdieren aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [bot, kraakbeen, spier, haar, hoorn, overig (gelieve te specificeren)]. Deze geringe aanwezigheid ligt onder de beslissingsgrens die voor deze microscopische methode is vastgesteld.’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster niet meer dan 5 deeltjes afkomstig van vissen aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [graat, schub, kraakbeen, spier, otoliet, kieuw, overig (gelieve te specificeren)]. Deze geringe aanwezigheid ligt onder de beslissingsgrens die voor deze microscopische methode is vastgesteld.’;
indien twee bepalingen zijn uitgevoerd:
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster bij de twee bepalingen niet meer dan 10 deeltjes afkomstig van gewervelde landdieren aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [bot, kraakbeen, spier, haar, hoorn, overig (gelieve te specificeren)]. Deze geringe aanwezigheid ligt onder de beslissingsgrens die voor deze microscopische methode is vastgesteld.’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster bij de twee bepalingen niet meer dan 10 deeltjes afkomstig van vissen aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [graat, schub, kraakbeen, spier, otoliet, kieuw, overig (gelieve te specificeren)]. Deze geringe aanwezigheid ligt onder de beslissingsgrens die voor deze microscopische methode is vastgesteld.’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster bij de twee bepalingen niet meer dan 10 deeltjes afkomstig van ongewervelde landdieren aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [cuticulaire fragmenten, monddelen, spieren, tracheale structuren, overig (gelieve te specificeren)]. Deze geringe aanwezigheid ligt onder de beslissingsgrens die voor deze microscopische methode is vastgesteld.’.
Bovendien:
- —
als het monster voorgezeefd is, wordt in het laboratoriumverslag vermeld in welke fractie (gezeefde fractie, pellets of pitten) de deeltjes van dierlijke oorsprong zijn aangetoond; worden alleen in de gezeefde fractie deeltjes van dierlijke oorsprong aangetoond, dan kan dat duiden op milieuverontreiniging;
- —
indien alleen dierlijk materiaal wordt aangetroffen dat niet als gewervelde landdieren of vissen kan worden ingedeeld (bv. spierweefsel), wordt in het verslag vermeld dat alleen dergelijke dierdeeltjes zijn aangetroffen en dat niet kan worden uitgesloten dat zij afkomstig zijn van gewervelde landdieren.
- 2.1.5.3.
Er zijn meer dan 5 deeltjes van een bepaalde type aangetoond indien slechts één bepaling is uitgevoerd, of er zijn meer dan 10 deeltjes van een bepaald type aangetoond in het geval van twee bepalingen:
indien slechts één bepaling is uitgevoerd:
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster meer dan 5 deeltjes afkomstig van gewervelde landdieren aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [bot, kraakbeen, spier, haar, hoorn, overig (gelieve te specificeren)].’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster meer dan 5 deeltjes afkomstig van vissen aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [graat, schub, kraakbeen, spier, otoliet, kieuw, overig (gelieve te specificeren)].’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster meer dan 5 deeltjes afkomstig van ongewervelde landdieren aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [cuticulaire fragmenten, monddelen, spieren, tracheale structuren, overig (gelieve te specificeren)].’;
indien twee bepalingen zijn uitgevoerd:
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster bij de twee bepalingen meer dan 10 deeltjes afkomstig van gewervelde landdieren aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [bot, kraakbeen, spier, haar, hoorn, overig (gelieve te specificeren)].’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster bij de twee bepalingen meer dan 10 deeltjes afkomstig van vissen aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [graat, schub, kraakbeen, spier, otoliet, kieuw, overig (gelieve te specificeren)].’;
- —
‘Voor zover met een lichtmicroscoop kon worden waargenomen, zijn in het onderzochte monster bij de twee bepalingen meer dan 10 deeltjes afkomstig van ongewervelde landdieren aangetoond. De deeltjes werden geïdentificeerd als … [cuticulaire fragmenten, monddelen, spieren, tracheale structuren, overig (gelieve te specificeren)].’.
Bovendien:
- —
als het monster voorgezeefd is, wordt in het laboratoriumverslag vermeld in welke fractie (gezeefde fractie, pellets of pitten) de deeltjes van dierlijke oorsprong zijn aangetoond; worden alleen in de gezeefde fractie deeltjes van dierlijke oorsprong aangetoond, dan kan dat duiden op milieuverontreiniging;
- —
indien alleen dierlijk materiaal wordt aangetroffen dat niet als gewervelde landdieren of vissen kan worden ingedeeld (bv. spierweefsel), wordt in het verslag vermeld dat alleen dergelijke dierdeeltjes zijn aangetroffen en dat niet kan worden uitgesloten dat zij afkomstig zijn van gewervelde landdieren.
2.2. PCR
2.2.1. Beginsel
In voedermiddelen of mengvoeders aanwezige fragmenten desoxyribonucleïnezuur (DNA) van dierlijke oorsprong worden aangetoond door amplificatie van soortspecifieke DNA-sequenties met behulp van PCR.
Eerst moet het DNA worden geëxtraheerd. Met het aldus verkregen DNA-extract wordt de amplificatiestap uitgevoerd om de met de test gezochte diersoort te kunnen aantonen.
2.2.2. Reagentia en apparatuur
2.2.2.1
Reagentia
2.2.2.1.1
Reagentia voor DNA-extractie.
Er mogen alleen door het EURL-AP goedgekeurde reagentia worden gebruikt, zoals vermeld op de website van dat laboratorium.
2.2.2.1.2
Reagentia voor DNA-amplificatie.
2.2.2.1.2.1
Primers en probes.
Er mogen alleen primers en probes met oligonucleotidesequenties worden gebruikt die door het EURL-AP zijn gevalideerd (4).
2.2.2.1.2.2
Mastermix.
Er mogen alleen mastermix-oplossingen worden gebruikt die vrij zijn van reagentia die fout-positieve resultaten kunnen veroorzaken door de aanwezigheid van dierlijk DNA (5).
2.2.2.1.2.3
Decontaminatiemiddelen.
2.2.2.1.2.3.1
Zoutzuur (0,1 N).
2.2.2.1.2.3.2
Chloorbleekmiddel (natriumhypochlorietoplossing met 0,15 % actief chloor).
2.2.2.1.2.3.3
Niet-corrosieve decontaminatiemiddelen voor kostbare apparatuur zoals analytische balansen (bv. DNA EraseTM van MP Biomedicals).
2.2.2.2
Uitrusting
2.2.2.2.1
Analytische balans, nauwkeurigheid 0,001 g.
2.2.2.2.2
Verkleiningsapparatuur.
2.2.2.2.3
Thermocycler voor realtime PCR.
2.2.2.2.4
Microcentrifuge voor microcentrifugebuizen.
2.2.2.2.5
Reeks micropipetten voor het pipetteren van hoeveelheden van 1 μl tot 1 000 μl.
2.2.2.2.6
Gebruikelijke kunststofartikelen voor moleculaire biologie: microcentrifugebuizen, kunststof micropipet-punten met filter, voor gebruik in de thermocycler geschikte platen.
2.2.2.2.7
Vrieskasten voor het bewaren van monsters en reagentia
2.2.3. Bemonstering en monstervoorbereiding
2.2.3.1
Bemonstering
Er wordt uitgegaan van een representatief monster dat is genomen overeenkomstig bijlage I.
2.2.3.2
Voorbereiding van het monster
De voorbereiding van de laboratoriummonsters tot aan de DNA-extractie wordt uitgevoerd volgens de voorschriften van bijlage II. Van het monster wordt een deelmonster voor analyse genomen van ten minste 50 g, dat wordt gemalen.
De monsters worden voorbereid in een andere ruimte dan de ruimten waar de DNA-extractie en DNA-amplificatie plaatsvinden, zoals beschreven in ISO-norm 24276.
Er worden twee analysemonsters van elk minimaal 100 mg voorbereid.
2.2.4. DNA-extractie
Van elk analysemonster wordt het DNA geëxtraheerd overeenkomstig de standaardwerkvoorschriften van het EURL-AP, die te vinden zijn op de website van dat laboratorium.
Voor elke extractiereeks worden twee extractiecontroles gemaakt zoals beschreven in ISO-norm 24276:
- —
een extractieblanco;
- —
een positieve DNA-extractiecontrole.
2.2.5. DNA-amplificatie
De DNA-amplificatie wordt uitgevoerd met de voor alle te identificeren diersoorten gevalideerde methoden. Die methoden staan vermeld in de standaardwerkvoorschriften van het EURL-AP, die te vinden zijn op de website van dat laboratorium. Elk DNA-extract wordt in ten minste twee verdunningen geanalyseerd om eventuele inhibitie te beoordelen.
Per gezochte diersoort worden twee amplificatiecontroles gemaakt zoals beschreven in ISO-norm 24276:
- —
een positieve DNA-doeldiercontrole voor elke plaat of reeks PCR-tests;
- —
een amplificatiereagenscontrole (‘no template control’) voor elke plaat of reeks PCR-tests.
2.2.6. Interpretatie en weergave van de resultaten
Bij de rapportage vermeldt het laboratorium ten minste de massa van de gebruikte analysemonsters, de gebruikte extractiemethode, het aantal uitgevoerde bepalingen en de aantoonbaarheidsgrens van de methode.
De resultaten mogen niet geïnterpreteerd en gerapporteerd worden als de positieve DNA-extractiecontrole en de positieve DNA-doeldiercontrole geen positieve resultaten voor de gezochte diersoort opleveren terwijl de amplificatiereagenscontrole negatief is.
Als de resultaten van de twee analysemonsters niet overeenstemmen, moet ten minste de amplificatiestap worden herhaald. Als het laboratorium vermoedt dat de DNA-extracten de oorzaak van de discrepantie zijn, moeten een nieuwe DNA-extractie en -amplificatie worden uitgevoerd voordat de resultaten geïnterpreteerd worden.
De uiteindelijke weergaven van de resultaten berust op de combinatie en interpretatie van de resultaten van beide analysemonsters overeenkomstig de standaardwerkvoorschriften van het EURL-AP, die te vinden zijn op de website van dat laboratorium.
2.2.6.1
Negatief resultaat
Een negatief resultaat wordt als volgt gerapporteerd:
In het onderzochte monster is geen DNA van X aangetoond (waarbij X die diersoort of groep diersoorten is waarnaar met de test werd gezocht).
2.2.6.2
Positief resultaat
Een positief resultaat wordt als volgt gerapporteerd:
In het onderzochte monster is een DNA van X aangetoond (waarbij X die diersoort of groep diersoorten is waarnaar met de test werd gezocht).
Voetnoten
Verordening (EG) nr. 999/2001 van het Europees Parlement en de Raad van 22 mei 2001 houdende vaststelling van voorschriften inzake preventie, bestrijding en uitroeiing van bepaalde overdraagbare spongiforme encefalopathieën (PB L 147 van 31.5.2001, blz. 1).
Verordening (EG) nr. 1069/2009 van het Europees Parlement en de Raad van 21 oktober 2009 tot vaststelling van gezondheidsvoorschriften inzake niet voor menselijke consumptie bestemde dierlijke bijproducten en afgeleide producten en tot intrekking van Verordening (EG) nr. 1774/2002 (verordening dierlijke bijproducten) (PB L 300 van 14.11.2009, blz. 1).
https://www.eurl.craw.eu/legal-sources-and-sops/method-of-reference-and-sops/.
De lijst van deze primers en probes voor elke met de test gezochte diersoort is te vinden op de website van het EURL-AP.
Voorbeelden van bruikbare mastermixen zijn te vinden op de website van het EURL-AP.