Uitvoeringsverordening (EU) 2015/1375 tot vaststelling van specifieke voorschriften voor de officiële controles op Trichinella in vlees:bijlage I

Uitvoeringsverordening (EU) 2015/1375 tot vaststelling van specifieke voorschriften voor de officiële controles op Trichinella in vlees

Bijlage I Detectiemethoden

Geldend

Documentgegevens:

Geldend vanaf 12-09-2022

Bronpublicatie:: 22-08-2022, PbEU 2022, L 218 (uitgifte: 23-08-2022, regelingnummer: 2022/1418)
Inwerkingtreding: 12-09-2022
Bronpublicatie inwerkingtreding:: 22-08-2022, PbEU 2022, L 218 (uitgifte: 23-08-2022, regelingnummer: 2022/1418)
Vakgebied(en): Gezondheidsrecht / Voedsel- en warenkwaliteit
Dierenrecht / Algemeen
Bestuursrecht algemeen / Toezicht

Hoofdstuk I. Referentiemethode

De referentiemethode voor het onderzoek van monsters op Trichinella is ISO 18743:2015.

Hoofdstuk II. Gelijkwaardige methoden

A. Verzameldigestiemethode met mechanische hulpmiddelen/sedimentatietechniek

1. Apparatuur en reagentia

a)

mes of schaar voor de monsterneming;

b)

schalen met een indeling in 50 vierkanten waarop steeds ongeveer 2 g vlees past, of andere hulpmiddelen die gelijkwaardige garanties bieden wat betreft de traceerbaarheid van de monsters;

c)

vleesmolen of elektrische hakker;

d)

Stomacher Lab-blender 3 500 Thermo model;

e)

kunststofzakken voor de Stomacher Lab-blender;

f)

conische scheitrechters, inhoud 2 l, bij voorkeur met teflon veiligheidsstop;

g)

statieven, ringen en klemmen;

h)

zeven, roestvrij staal of messing, maaswijdte 180 micron, uitwendige diameter 11 cm;

i)

trechters, inwendige diameter ten minste 12 cm, als steun voor de zeven;

j)

glazen maatcilinders, 100 ml;

k)

thermometer, nauwkeurig tot op 0,5 °C in het meetgebied 20-70 °C;

l)

trilapparaat, bv. een elektrisch scheerapparaat waarvan de kop is verwijderd;

m)

relais dat om de minuut aan- en uitschakelt;

n)

trichinoscoop met horizontale tafel of stereomicroscoop, met regelbare, doorvallende verlichting;

o)

petrischalen, diameter van ongeveer 90 mm, gerasterd met vierkante mazen van ongeveer 1 cm, of een gelijkwaardig instrument voor het tellen van larven zoals in punt 6.14 van ISO 18743:2015;

p)

zoutzuur 17,5 %;

q)

pepsine, gehalte:

—: indien in poeder- of korrelvorm: 1:10 000NF (US National Formulary), overeenkomend met 1:12 500BP (British Pharmacopoeia), oftewel 2 000FIP (Fédération Internationale de Pharmacie), of
—: indien in vloeibare vorm: gestabiliseerde vloeibare pepsine met minimaal 660 eenheden van de Europese Farmacopee/ml.

Er kunnen andere pepsineactiviteiten worden gebruikt, mits de uiteindelijke activiteit in de digestievloeistof gelijk is aan de activiteit van 10 g van 1:10 000NF, zoals bepaald in punt 5.3 van ISO 18743:2015.

r)

bakken van 10 l voor ontsmetting (bv. met formaline) van de apparatuur en voor resterende digestievloeistoffen bij een positief resultaat;

s)

gekalibreerde balans, voor het wegen van monsters en/of pepsine (nauwkeurig tot op ± 0,1 g).

2. Monsterneming en benodigde hoeveelheid monster

Zoals bepaald in punt 4.2 van ISO 18743:2015 (zie ook de bijlagen A en B bij die norm voor nadere bijzonderheden).

3. Werkwijze

I. Malen

Als de vleesmonsters eerst in een vleesmolen worden gemalen, verloopt het digestieproces beter. Bij gebruik van een hakker wordt drie- à viermaal gedurende één seconde gemalen.

II. Digestieprocedure

Deze procedure kan worden gebruikt voor complete pools (telkens 100 g monster) en voor pools van minder dan 100 g.

a)

Complete pools (100 monsters tegelijk):

i): Doe een dubbele kunststofzak in de Stomacher Lab-blender 3 500 en stel de temperatuurregeling in op 40–41 °C.
ii): Doe in de binnenste kunststofzak 1,5 l water van 40–41 °C.
iii): Voeg aan het water in de Stomacher 25 ml 17,5 % zoutzuur toe.
iv): Doe hierbij 100 monsters van elk ongeveer 1 g (25–30 °C) die overeenkomstig punt 2 zijn genomen van de afzonderlijke monsters.
v): Voeg als laatste 6 g pepsine of 18 ml vloeibare pepsine toe. Aan deze volgorde moet strikt de hand worden gehouden om ontleding van de pepsine te voorkomen.
vi): Maak de inhoud van de zak 25 minuten lang fijn in de Stomacher.
vii): Haal de kunststofzak uit de Stomacher en filtreer de digestievloeistof door een zeef in een 3 l-bekerglas.
viii): Was de kunststofzak met ongeveer 100 ml water, spoel vervolgens daarmee de zeef na en voeg het spoelwater bij het filtraat in het bekerglas.
ix): Maximaal 15 afzonderlijke monsters kunnen bij andere monsters worden gevoegd tot een totaal van 100 en tegelijk daarmee worden onderzocht.

b)

Kleinere pools (minder dan 100 monsters):

i): Doe een dubbele kunststofzak in de Stomacher Lab-blender 3 500 en stel de temperatuurregeling in op 40–41 °C.
ii): Bereid de digestievloeistof door menging van ongeveer 1,5 l water en 25 ml zoutzuur 17,5 %. Voeg 6 g pepsine toe en meng het geheel op een temperatuur van 40–41 °C. Aan deze volgorde moet strikt de hand worden gehouden om ontleding van de pepsine te voorkomen.
iii): Meet van de digestievloeistof een volume dat overeenkomt met 15 ml per g monster af (bv. voor 30 monsters 30 × 15 ml = 450 ml) en breng dit over in de binnenste van de twee kunststofzakken; voeg hier tegelijk de vleesmonsters van ongeveer 1 g (op 25–30 °C) bij die overeenkomstig punt 2 van elk van de afzonderlijke monsters zijn genomen.
iv): Vul de buitenste zak met water met een temperatuur van ongeveer 41 °C tot een totaal volume in de twee zakken van 1,5 l. Maak de inhoud van de zak 25 minuten lang fijn in de Stomacher.
v): Haal de kunststofzak uit de Stomacher en filtreer de digestievloeistof door een zeef in een 3 l-bekerglas.
vi): Was de kunststofzak met ongeveer 100 ml water (van 25–30 °C), spoel vervolgens daarmee de zeef na en voeg het spoelwater bij het filtraat in het bekerglas.

III. Isolatie van de larven door middel van sedimentatie

—: Voeg aan de digestievloeistof zoveel ijs (300-400 g, blokjes of schilfers) toe dat het totaalvolume ongeveer 2 liter is. Roer het mengsel tot het ijs is gesmolten. Neem bij kleinere pools (zie punt II, b)), evenredig minder ijs.
—: Breng de gekoelde digestievloeistof over in een scheitrechter van 2 liter die voorzien is van een trilapparaat in een afzonderlijke klem.
—: Laat de inhoud van de scheitrechter 30 minuten bezinken, waarbij een minuut trillen steeds wordt afgewisseld met een minuut rust.
—: Laat na 30 minuten 60 ml van het sediment snel uitlopen in een maatcilinder van 100 ml (spoel de trechter na gebruik met een reinigingsmiddel).
—: Laat de 60 ml gedurende ten minste tien minuten bezinken, zuig dan zoveel van de bovenstaande vloeistof af dat 15 ml overblijft, die wordt onderzocht op de aanwezigheid van larven.
—: Voor het afzuigen kan een wegwerpspuit worden gebruikt, voorzien van een kunststofslang, van een zodanige lengte dat wanneer de flenzen van de spuit op de rand van de maatcilinder rusten nog 15 ml in de maatcilinder overblijft.
—: Giet de overblijvende 15 ml in een petrischaal of een gelijkwaardig instrument voor het tellen van larven en bekijk deze met een trichinoscoop dan wel een stereomicroscoop.
—: Spoel de maatcilinder met 5-10 ml leidingwater en voeg het spoelwater bij het monster.
—: Onderzoek de verteerde monsters zodra zij gereed zijn. Het onderzoek mag onder geen voorwaarde worden uitgesteld tot de volgende dag.

Indien de monsters niet helder, worden ze als volgt geklaard.

—: Het uiteindelijke monster van 60 ml wordt overgebracht in een maatcilinder en daarin tien minuten met rust gelaten. Daarna wordt 45 ml van de bovenstaande vloeistof door afzuigen verwijderd en wordt de overblijvende 15 ml met leidingwater aangevuld tot 45 ml.
—: Na nogmaals tien minuten bezinken wordt 30 ml van de bovenstaande vloeistof door afzuigen verwijderd en wordt de resterende 15 ml voor onderzoek in een petrischaal of een gelijkwaardig instrument voor het tellen van larven gegoten en onderzocht met een trichinoscoop dan wel een stereomicroscoop.
—: De maatcilinder wordt nagespoeld met maximaal 10 ml leidingwater en deze spoelingen worden vervolgens gevoegd bij de inhoud van petrischaal of een gelijkwaardig instrument voor het tellen van larven en onderzocht met een trichinoscoop dan wel een stereomicroscoop.

IV. Positieve of twijfelachtige uitslagen

Bij een positieve of twijfelachtige uitslag van een verzamelmonster wordt van elk varken nogmaals een monster van 20 g genomen, zoals bepaald in punt 4.2 van ISO 18743:2015 (zie ook de bijlagen A en B bij die norm voor nadere bijzonderheden). Deze monsters van 20 g worden per vijf varkens samengevoegd en volgens de in dit hoofdstuk beschreven werkwijze onderzocht. Aldus worden monsters van twintig groepen van vijf varkens onderzocht. Wanneer in een verzamelmonster van vijf varkens Trichinella wordt aangetoond, worden van alle varkens in de groep nogmaals monsters van 20 g genomen, die elk afzonderlijk volgens de in dit hoofdstuk beschreven werkwijze worden onderzocht. Parasietmonsters worden in ethanol 70-90 % (eindconcentratie) geconserveerd voor de identificatie van de soort in het EU- of nationale referentielaboratorium. Voor de ontsmettingsprocedure, zie punt 12 van ISO 18743:2015.

B. Verzameldigestiemethode met mechanische hulpmiddelen/‘isolatie op filter’-techniek

1. Apparatuur en reagentia

Zie punt A.1.

Verdere apparatuur:

a): Gelmantrechter van 1 l met filterhouder (diameter 45 mm);
b): filterschijven, bestaande uit rond roestvrijstalen gaas met openingen van 35 micron (diameter schijf: 45 mm) en twee rubberringen van 1 mm dik (uitwendige diameter 45 mm, inwendige diameter 38 mm). Het gaas wordt met een geschikte tweecomponentenlijm tussen de twee rubberringen bevestigd;
c): afzuigerlenmeyer, 3 l;
d): afzuigpomp;
e): kunststofzakken met een inhoud van ten minste 80 ml;
f): sealapparaat voor de kunststofzakken;
g): rennilase, 1:150 000 Soxhleteenheden per g.

2. Monsterneming

Zoals bepaald in punt 4.2 van ISO 18743:2015 (zie ook de bijlagen A en B bij die norm voor nadere bijzonderheden).

3. Werkwijze

I. Malen

Als de vleesmonsters eerst in een vleesmolen worden gemalen, verloopt het digestieproces beter. Bij gebruik van een hakker wordt drie- à viermaal gedurende een seconde gemalen.

II. Digestieprocedure

Deze procedure kan worden gebruikt voor complete pools (telkens 100 g monster) en voor pools van minder dan 100 g.

a): Complete pools (100 monsters tegelijk)
Zie punt A.3.II, onder a).
b): Kleinere pools (minder dan 100 monsters)
Zie punt A.3.II, onder b).

III. Isolatie van de larven door filtratie

a)

Voeg aan de digestievloeistof zoveel ijs (300–400 g, blokjes of schilfers) toe dat het totaalvolume ongeveer 2 l is. Neem bij kleinere pools evenredig minder ijs.

b)

Roer het mengsel tot het ijs is gesmolten. Laat de gekoelde digestievloeistof ten minste 3 minuten staan zodat de larven zich kunnen oprollen.

c)

Plaats de Gelmantrechter met daarin de filterhouder en filterschijf op de erlenmeyer en sluit die aan op de afzuigpomp.

d)

Giet de digestievloeistof in de Gelmantrechter en filtreer. Na enige tijd kan het filtratieproces worden versneld door met de afzuigpomp af te zuigen. Het afzuigen moet worden stopgezet voordat het filter droogloopt, dit wil zeggen wanneer zich nog 2 tot 5 ml vloeistof in de trechter bevindt.

e)

Doe, wanneer alle digestievloeistof is gefiltreerd, de filterschijf in een kunststofzak van 80 ml en voeg daaraan 15–20 ml rennilaseoplossing toe. De rennilaseoplossing wordt bereid door 2 g rennilase op te lossen in 100 ml leidingwater.

f)

Voorzie de kunststofzak van een dubbele seal en plaats hem in de Stomacher tussen de binnenste en de buitenste zak.

g)

Maak de inhoud gedurende drie minuten fijn in de Stomacher, bijvoorbeeld wanneer deze een complete of incomplete pool behandelt.

h)

Neem na drie minuten de kunststofzak met filterschijf en rennilaseoplossing uit de Stomacher en knip hem met een schaar open. Giet de vloeibare inhoud in een petrischaal of een gelijkwaardig instrument voor het tellen van larven. Was de zak met 5-10 ml water, voeg dat bij de overige vloeistof in de petrischaal of een gelijkwaardig instrument voor het tellen van larven en onderzoek het met een trichinoscoop dan wel een stereomicroscoop.

i)

Onderzoek de verteerde monsters zodra zij gereed zijn. Het onderzoek mag onder geen voorwaarde worden uitgesteld tot de volgende dag.

NB:

Geen filterschijven gebruiken die niet helemaal schoon zijn. Schijven die niet schoon zijn nooit laten drogen. Filterschijven kunnen worden gereinigd door ze de hele nacht in een rennilaseoplossing te laten staan. Vóór gebruik de schijven in de Stomacher spoelen met verse rennilaseoplossing.

IV. Positieve of twijfelachtige uitslagen

Zoals vastgesteld in punt A.3, IV.

C. Automatische verzameldigestiemethode voor monsters tot 35 g

1. Apparatuur en reagentia

a)

mes of schaar voor de monsterneming;

b)

schalen met een indeling in 50 vierkanten waarop steeds ongeveer 2 g vlees past, of andere hulpmiddelen die gelijkwaardige garanties bieden wat betreft de traceerbaarheid van de monsters;

c)

Trichomatic 35® blender met filtreerset;

d)

zoutzuur 8,5 ± 0,5 % (m/m);

e)

transparante membraanfilters van polycarbonaat met een diameter van 50 mm en poriën van 14 micron;

f)

pepsine, gehalte:

—: indien in poeder- of korrelvorm: 1:10 000NF (US National Formulary), overeenkomend met 1:12 500BP (British Pharmacopoeia), oftewel 2 000FIP (Fédération Internationale de Pharmacie), of
—: in vloeibare vorm: gestabiliseerde vloeibare pepsine met minimaal 660 eenheden van de Europese Farmacopee/ml.

Er kunnen andere pepsineactiviteiten worden gebruikt, mits de uiteindelijke activiteit in de digestievloeistof gelijk is aan de activiteit van 10 g van 1:10 000NF zoals bepaald in punt 5.3 van ISO 18743:2015.

g)

gekalibreerde balans, voor het wegen van monsters en/of pepsine (nauwkeurig tot op ± 0,1 g).

h)

pincet met platte punt;

i)

objectglaasjes waarvan de lengte van de zijden ten minste 5 cm bedraagt of een aantal petrischalen met een diameter van ten minste 6 cm, waarop op de onderzijden met een scherp voorwerp een onderverdeling in vierkanten van 10 × 10 mm is aangebracht;

j)

(stereo)microscoop met doorvallend licht (vergroting 15 tot 60 ×) of trichinoscoop met horizontale tafel;

k)

bak voor het opvangen van vloeibare afvalstoffen;

l)

bakken van 10 l voor ontsmetting (bv. met formaline) van de apparatuur en voor resterende digestievloeistoffen bij een positief resultaat;

m)

een thermometer, nauwkeurig tot op 0,5 °C in het meetgebied 20-70 °C

2. Monsterneming

Zoals bepaald in punt 4.2 van ISO 18743:2015 (zie ook de bijlagen A en B bij die norm voor nadere bijzonderheden).

3. Werkwijze

I. Digestieprocedure

a): Sluit op de van een filterset voorziene blender een afvoerslang aan en leidt deze slang naar de afvalbak.
b): Zodra de blender in werking wordt gesteld, begint de opwarming.
c): Voordat de blender wordt aangezet moet de onderste klep, die zich onder de reactiekamer bevindt, worden geopend en gesloten.
d): Vervolgens worden maximaal 35 monsters van elk ongeveer 1 g (op een temperatuur van 25–30 °C) toegevoegd die overeenkomstig punt 2 van de afzonderlijke monsters zijn genomen. Grotere stukken pees moeten worden verwijderd om verstopping van het membraanfilter te voorkomen.
e): Vul een met de blender in verbinding staand vloeistofreservoir tot aan de rand met water (± 400 ml).
f): Vul het kleinere, met de blender in verbinding staand vloeistofreservoir tot aan de rand gevuld met ongeveer 30 ml zoutzuur 8,5 %.
g): Zet in de filterhouder van de filtreerset onder het grove filter een membraanfilter.
h): Voeg als laatste 7 g pepsine of 21 ml vloeibare pepsine toe. Aan deze volgorde moet strikt de hand worden gehouden om ontleding van de pepsine te voorkomen.
i): Sluit de deksels van de reactiekamer en de vloeistofreservoirs.
j): Stel de gewenste digestietijd in. Wanneer de monsters afkomstig zijn van varkens die op een voor deze diersoort normale leeftijd zijn geslacht, geldt een korte digestietijd (vijf minuten), in alle andere gevallen een langere (acht minuten).
k): Door de startknop van de blender aan te zetten wordt een automatisch proces van vloeistoftoevoeging, digestie en filtratie in gang gezet. Het hele proces duurt 10 tot 13 minuten en stopt automatisch.
l): Open het deksel van de reactiekamer om te controleren of de kamer leeg is. Wanneer schuim of resten van de digestievloeistof in de kamer zijn achtergebleven, moet een nieuwe digestieprocedure worden ingezet zoals beschreven onder punt V.

II. Isolatie van de larven

a): Neem het membraanfilter uit de filterhouder en leg het op een objectglaasje of een petrischaal.
b): Onderzoek het membraanfilter met behulp van een (stereo)microscoop of trichinoscoop.

III. Reiniging van de apparatuur

a): Vul, indien de uitslag positief is, de reactiekamer van de blender voor twee derde met kokend water. Vul het bijbehorende vloeistofreservoir tot boven de onderste peilsensor met leidingwater. Vervolgens vindt automatische reiniging plaats. Ontsmet de filterhouder en eventuele andere apparatuur, bv. met formaline.
b): Vul na beëindiging van de werkzaamheden voor de dag het vloeistofreservoir van de blender met water en laat het standaardprogramma lopen.

IV. Gebruik van membraanfilters

Een membraanfilter van polycarbonaat mag ten hoogste vijf keer worden gebruikt. Het filter moet na elk gebruik worden omgekeerd. Bovendien moet het filter na elk gebruik worden gecontroleerd op eventuele beschadigingen waardoor het ongeschikt zou zijn om nog verder te worden gebruikt.

V. Werkwijze wanneer het digestieproces niet helemaal is voltooid en filtratie daarom niet mogelijk is

Na afloop van de automatische digestie zoals beschreven in punt I, wordt het deksel van de reactiekamer geopend om na te gaan of in de reactiekamer schuim of vloeistoffen zijn achtergebleven. Als dit het geval is, wordt als volgt te werk gegaan.

a): Sluit de onderste klep van de reactiekamer.
b): Neem het membraanfilter uit de filterhouder en leg het op een objectglaasje of een petrischaal.
c): Doe een nieuw membraanfilter in de filterhouder en zet de filterhouder weer in de blender.
d): Vul het vloeistofreservoir van de blender tot boven de onderste peilsensor met water.
e): Laat het automatische reinigingsprogramma lopen.
f): Open na afloop van het reinigingsprogramma het deksel van de reactiekamer en controleer op eventuele vloeistofresten.
g): Als de kamer leeg is, neem dan de filterhouder uit de blender en leg het membraanfilter met een pincet op een objectglaasje of een petrischaal.
h): Onderzoek de twee membraanfilters zoals aangegeven in punt II. Als onderzoek van de filters niet mogelijk is, wordt het gehele in punt I beschreven digestieproces overgedaan, met een langere digestietijd.

VI. Positieve of twijfelachtige uitslagen

Zoals vastgesteld in punt A.3, IV.

D. Magneetroerdermethode voor verzameldigestie‘/isolatie op filter’ en detectie van larven door een latexagglutinatietest

Deze methode wordt alleen als gelijkwaardig beschouwd voor de controle van vlees van gedomesticeerde varkens.

1. Apparatuur en reagentia

a)

mes of schaar en pincet voor de monsterneming;

b)

schalen met een indeling in 50 vierkanten waarop steeds ongeveer 2 g vlees past, of andere hulpmiddelen die gelijkwaardige garanties bieden voor de traceerbaarheid van de monsters;

c)

een hakker met een scherp mes. Indien de monsters zwaarder zijn dan 3 g, moet een vleesmolen met openingen van 2–4 mm of een schaar worden gebruikt. In het geval van bevroren vlees of tong (na verwijdering van het vel, dat niet kan worden verteerd) is een vleesmolen nodig en moet een aanzienlijk grotere hoeveelheid monster worden genomen;

d)

magneetroerders met een van een temperatuurregelaar voorziene verwarmingsplaat en met teflon beklede roerstaafjes van ongeveer 5 cm lang;

e)

bekerglazen, 3 l;

f)

zeven, roestvrij staal, maaswijdte 180 micron, uitwendige diameter 11 cm;

g)

stalen filtratieapparaat voor filters met 20 μm maaswijdte met een stalen trechter;

h)

vacuümpomp;

i)

metalen of plastic tanks, inhoud 10–15 l, voor het opvangen van de digestievloeistof;

j)

een driedimensionale roterende schudder;

k)

aluminiumfolie;

l)

zoutzuur 25 %;

m)

pepsine, gehalte:

—: indien in poeder- of korrelvorm: 1:10 000NF (US National Formulary), overeenkomend met 1:12 500BP (British Pharmacopoeia), oftewel 2 000FIP (Fédération Internationale de Pharmacie), of
—: in vloeibare vorm: gestabiliseerde vloeibare pepsine met minimaal 660 eenheden van de Europese Farmacopee/ml.

n)

leidingwater, verwarmd tot 46–48 °C;

o)

gekalibreerde balans, voor het wegen van monsters en/of pepsine (nauwkeurig tot op ± 0,1 g).

p)

pipetten van verschillende maten (1, 10 en 25 ml), micropipetten volgens de instructies van de fabrikant van de latexagglutinatietest en pipethouders;

q)

filters van nylon met een maaswijdte van 20 micron met een diameter die op het filtratiesysteem past;

r)

plastic of stalen pincet van 10–15 cm;

s)

conische monsterflesjes/buisjes van 15 ml;

t)

een stamper met een conisch uiteinde van teflon of staal die in de conische monsterflesjes/buisjes past;

u)

een thermometer, nauwkeurig tot op 0,5 °C in het meetgebied 20-70 °C;

v)

latexagglutinatiekaarten van de Trichin-L-antigeentestkit gevalideerd onder code nr. EURLP_D_001/2011;

w)

bufferoplossing met conserveermiddel (monsterverdunner) van de Trichin-L-antigeentestkit gevalideerd onder code nr. EURLP_D_001/2011;

x)

buffer aangevuld met conserveermiddel (negatieve controle) van de Trichin-L-antigeentestkit gevalideerd onder code nr. EURLP_D_001/2011;

y)

buffer aangevuld met Trichinella spiralis-antigenen en conserveermiddel (positieve controle) van de Trichin-L-antigeentestkit gevalideerd onder code nr. EURLP_D_001/2011;

z)

buffer met polystyreendeeltjes gecoat met antilichamen aangevuld met conserveermiddel (latexdruppels) van the Trichin-L-antigeentestkit gevalideerd onder code nr. EURLP_D_001/2011;

aa)

wegwerpstaafjes.

2. Monsterneming

Zoals bepaald in punt 4.2 van ISO 18743:2015 (zie ook de bijlagen A en B bij die norm voor nadere bijzonderheden).

3. Werkwijze

I. Voor complete pools (100 g monster tegelijk)

a): Voeg in een 3 l-bekerglas met 2,0 l ± 200 ml tot 46–48 °C voorverwarmd leidingwater 16 ± 0,5 ml 25 % zoutzuur toe (een uiteindelijke concentratie van 0,2 %). Plaats een roerstaafje in het bekerglas, zet het op de voorverwarmde plaat en start het roeren.
b): Voeg 10 ± 1 g pepsinepoeder (of 30 ± 3 ml vloeibare pepsine) toe.
c): Hak 100–115 g van de overeenkomstig punt 2 genomen monsters in de hakker, met 150 ml ± 15 ml voorverwarmde digestiebuffer.
d): Breng het fijngehakte vlees over in het 3 l-bekerglas met water, pepsine en zoutzuur.
e): Dompel het hakmes van de hakker enige malen in de digestievloeistof in het bekerglas en spoel de kom van de hakker om met wat digestievloeistof om eventuele vleesresten te verwijderen.
f): Dek het bekerglas af met aluminiumfolie.
g): Stel de magneetroerder zo in dat een constante temperatuur van 44–46 °C wordt gehandhaafd. Vervolgens wordt de roerder aangezet, waarbij de digestievloeistof zo snel moet ronddraaien dat een diepe kolk zonder spatten ontstaat.
h): Roer de digestievloeistof tot de vleesdeeltjes zijn verteerd (ongeveer 30 minuten). Schakel de roerder uit en giet de vloeistof door de zeef in de bezinkingstrechter. Voor bepaalde soorten vlees (tong, vlees van wild enz.) kunnen langere digestietijden nodig zijn (maximaal 60 minuten).
i): Het digestieproces is naar behoren verlopen als op de zeef niet meer dan 5 % van het uitgangsgewicht achterblijft.
j): Het filter (nylon, 20 micron maaswijdte) wordt op de filterhouder geplaatst. De stalen conische filtertrechter wordt op de houder bevestigd met het blokkeersysteem en de stalen zeef met een maaswijdte van 180 micron wordt op de trechter geplaatst. De vacuümpomp wordt op de filterhouder en de metalen of plastic tank aangesloten om de digestievloeistof op te vangen.
k): Stop met roeren en giet de digestievloeistof door de zeef in de filtertrechter. Spoel het bekerglas met ongeveer 250 ml warm water. Giet de spoelvloeistof in het filter nadat de digestievloeistof is doorgelopen.
l): Pak met het pincet het filtratiemembraan op bij de rand. Vouw het (minimaal) in vieren en plaats het in de 15 ml conische buis. De keuze van de conische buis moet aan de stamper zijn aangepast.
m): Het filtratiemembraan wordt met de stamper naar de bodem van de 15 ml conische buis gedrukt en krachtig samengeperst door de stamper, die in het gevouwen filtratiemembraan dient te zijn geplaatst, ongeveer twintig keer na elkaar heen en weer te bewegen overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
n): 0,5 ml ± 0,01 ml monsterverdunner wordt met een pipet in de 15 ml conische buis toegevoegd en het filtratiemembraan wordt gehomogeniseerd met behulp van de stamper, door achtereenvolgende korte bewegingen heen en weer gedurende ongeveer 30 seconden, waarbij abrupte bewegingen vermeden moeten worden om morsen van de vloeistof te vermijden, overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
o): De afzonderlijke monsters, de negatieve controle en de positieve controle worden met pipetten op verschillende velden van de agglutinatiekaart gebracht, overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
p): De latexdruppels worden met pipetten op ieder veld van de agglutinatiekaart toegevoegd, overeenkomstig de instructies van de fabrikant, zonder ze in aanraking te brengen met de monsters en controles. Vervolgens worden op ieder veld de latexdruppels voorzichtig gemengd met een wegwerpstaafje totdat de homogene vloeistof het gehele veld bedekt.
q): De agglutinatiekaart wordt op de driedimensionale schudder geplaatst en gedurende 10 ± 1 minuut geschud overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
r): Na de in de instructies van de fabrikant aangegeven tijd wordt het schudden gestopt en wordt de agglutinatiekaart op een vlak oppervlak gelegd en worden de reactieresultaten onmiddellijk afgelezen overeenkomstig de instructies van de fabrikant. Bij een positief monster moeten druppelaggregaten verschijnen. Bij een negatief monster blijft de suspensie homogeen zonder druppelaggregaten.

II. Pools van minder dan 100 g zoals bedoeld in punt 8 van ISO 18743:2015

Indien nodig kan maximaal 15 g worden toegevoegd aan een pool van 100 g totaal en tegelijk met deze monsters worden onderzocht volgens de procedure zoals beschreven onder punt I. Meer dan 15 g moet als een complete pool worden onderzocht. Voor pools tot 50 g kan voor de bereiding van de digestievloeistof worden volstaan met 1 liter water, 8 ml zoutzuur en 5 g pepsine.

III. Positieve of twijfelachtige uitslagen

Bij een positieve of twijfelachtige latexagglutinatie-uitslag van een verzamelmonster wordt van elk varken nogmaals een monster van 20 g genomen, zoals bepaald in punt 4.2 van ISO 18743:2015 (zie ook de bijlagen A en B bij die norm voor nadere bijzonderheden). De 20 g monsters van vijf varkens worden gepoold en onderzocht volgens de in punt I beschreven methode. Monsters van twintig groepen van vijf varkens dienen te worden onderzocht.

Wanneer een positieve latexagglutinatie wordt verkregen van een groep van vijf varkens, worden van alle varkens in de groep nogmaals monsters van 20 g genomen, die elk afzonderlijk volgens de in punt I beschreven methode worden onderzocht.

Bij een positieve of twijfelachtige latexagglutinatie-uitslag moet minstens 20 g varkensspier naar het nationale referentielaboratorium worden gestuurd voor bevestiging met gebruikmaking van ISO 18743:2015 of een van de hierboven bedoelde equivalente methoden.

Parasietmonsters worden in ethanol 70-90 % (eindconcentratie) geconserveerd voor de identificatie van de soort in het EU- of nationale referentielaboratorium.

Na verzameling van de parasieten moeten positieve vloeistoffen worden gedecontamineerd door ze tot minimaal 60 °C te verhitten.

IV. Reinigings- en ontsmettingprocedure na een positieve of twijfelachtige uitslag

Bij een positieve of twijfelachtige latexagglutinatie-uitslag van een verzamelmonster of afzonderlijk monster moet alle uitrusting die in aanraking komt met vlees (kom van de hakker en mes, stamper, bekerglas, roerstaafje, temperatuursensor, conische filtertrechter, zeef en pincet) zorgvuldig worden ontsmet door deze enkele seconden in heet water (65–90 °C) onder te dompelen. Oppervlakken waarop zich nog vleesresten of geïnactiveerde larven bevinden, kunnen met een schone spons en leidingwater worden schoongemaakt. Indien nodig kunnen een paar druppels reinigingsmiddel aan het water worden toegevoegd om de uitrusting te ontvetten. Het verdient aanbeveling daarna elk voorwerp grondig af te spoelen om alle sporen van het reinigingsmiddel te verwijderen.

E. Artificiële digestietest voor in vitro detectie van larven van Trichinella spp. in vleesmonsters, PrioCHECK® Trichinella AAD Kit

Deze methode wordt alleen als gelijkwaardig beschouwd voor de controle van vlees van gedomesticeerde varkens.

De PrioCHECK® Trichinella AAD Kit wordt gebruikt overeenkomstig de handleiding van de kit met behulp van scheitrechters (Lenz NS 29/32) en een glazen reageerbuis van 80 ml.